Hola ese error te puede dar por un monton de motivos, a veces cuando windows se actualiza cambia los permisos del usuario aspnet, de los directorios del directorio de la aplicacion o lo que sea, de todas el error 500 es muy generico para saber, deberias ver bien cual es el error en el log de windows (panel de control -> herramientas adminitrativas-> visor de suceso) y buscar el codigo de error en la pagina msdn de
www.microsoft.com/msdn (yo he solucionado esos problemas sacandolos de esta pagina)